MTT的应用

MTT法又称MTT比色法，是一种j9游会真人游戏第一品牌细胞存活和生长的方法。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性j9游会真人游戏第一品牌、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。但是它的缺点也很多，如果操作和数据处理方法不当，结果可信度和可重复性很低。

MTT主要有两个用途

1.药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定；

2.细胞增殖及细胞活性测定。

MTT的原理

MTT商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。

j9游会真人游戏第一品牌原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫j9游会真人游戏第一品牌仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。

MTT工作浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中，用0.22μm 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放-20℃避光保存即可。

实验步骤

1)铺板，使用96孔板，每孔细胞密度控制在4000-5000个，体积100μl每孔。

2)5%CO2，37℃孵育，正常4到6小时贴壁后即可,加入浓度梯度的药物。

3)5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4)每孔加入20µlMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。若药物与MTT反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5)终止培养，一次性像泼水一样，直接泼掉孔中的液体。

6)每孔加入150µl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫j9游会真人游戏第一品牌仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

试剂材料准备与实验仪器

1)对数生长期细胞

2)受试因素(药物)

3)MTT：以PBS配制成5mg/ml，抽滤除菌，保存在4˚C

4)DMSO(二甲基亚砜)

5)96孔板

6)酶联免疫j9游会真人游戏第一品牌仪

7)细胞培养箱

常用铺板方法

灰色为边缘孔，加入无菌PBS；绿色为空白组，不加细胞，只加入培养基和MTT。

黄色为对照组，加入细胞，不加药；蓝色为实验组，加入细胞和药物。

实验注意事项

MTT实验的主要缺点在于如果操作和数据处理方法不当，结果可信度和可重复性很低，以拟合化合物IC50为例介绍操作中注意事项：

1)严格控制铺板密度和给药浓度(对结果影响最大)

96孔板孔径很小，如果细胞密度过大，药物对肿瘤的抑制作用作用越小。同时，收样前，对照组孔内如果已经长满细胞，就不能模拟出48小时后细胞的真实数量，对结果也有影响。

根据经验，建议铺板时每孔细胞个数在4000左右，给药时细胞密度控制在30%左右。孔底的细胞一定要均匀分布。

2)注意边缘效应

细胞培养过程中，边孔水分蒸发很快，因此边孔内药物浓度会浓缩，细胞状况会更复杂。因此铺板只用中间60孔，边缘36孔加入无菌PBS。

3)给药浓度

为拟合IC50，通常设置10个给药浓度，每种浓度5个复孔。收样时，最高浓度孔内细胞一定要抑制率能够达到90以上，并且同时有2个及以上点抑制率都能达到90%以上。

4)避光操作

MTT一般4度保存两周，注意避光保存，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。

5)培养液

贴壁细胞加MTT前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加入 0.5%MTT，量为20ul/孔。

结果分析

将各孔OD值减去本底OD值(培养基+MTT+DMSO，不含细胞)或者对照组OD值，各个复孔取平均值±SD值即为最终结果。

改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg 最大剂量

I:lg(最大剂量/相临剂量)

P:阳性反应率之和

Pm:最大阳性反应率

Pn:最小阳性反应率

举个例子：各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值如下：

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值，如对于100ug/ml的药物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各组抑制率如下：

代入计算公式：

Pm=0.869

Pn=0.135

P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142

Xm=lg100=2

lgI=lg100/50=0.301

lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655

IC50=45.186

该药物的IC50值为45.186ug/ml